Infecções pelo vírus da gripe aviária altamente patogênica (GAAP) A (H5N1) clade 2.3.4.4b genótipo B3.13 foram relatadas em vacas leiteiras no Texas, EUA, pela primeira vez em março de 2024 (1–3); seguiu-se uma rápida propagação do vírus. Em 18 de dezembro de 2025, mais de 1.084 rebanhos em 19 estados dos EUA foram afetados; a maioria dos rebanhos está na Califórnia (4). Relatamos a detecção do vírus HPAI H5N1 clade 2.3.4.4b genótipo B3.13 em um lote de soro fetal bovino (FBS) durante testes de rotina.
Em fevereiro de 2025, muitos FBS foram recebidos do Laboratório de Virologia do Cornell Animal Health Diagnostic Center (AHDC; Ithaca, NY, EUA) para testes de rotina de agentes externos, conforme exigido pelo Código de Regulamentações Federais (9CFR) Título 9 para Produtos Biológicos de Origem Animal (§113.53, §113.46, §113.47). O FBS testado consistiu em um conjunto de amostras coletadas em 5 estados (Pensilvânia, Kansas, Nebraska, Carolina do Sul e Califórnia). Testamos a amostra conforme prescrito no 9CFR semeando células Vero (ATCC CCL-81) e células primárias de rim bovino fetal (FBK) desenvolvidas pelo Laboratório de Virologia AHDC em frascos de cultura de tecidos T75 em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 2% de penicilina/estreptomicina e 15% (concentração final) da amostra de teste FBS. Mantivemos as células por 7 dias e observamos a citopatologia. As células FBK não apresentaram efeito citopático viral (CPE), mas foram positivas para o vírus da diarreia viral bovina não citopática por coloração com ensaio de imunofluorescência específico do vírus (IFA) no dia 7. Observamos CPE em células Vero no dia 7 após a inoculação. O teste IFA subsequente de células Vero foi negativo para vírus bovinos listados no 9CFR (isto é, vírus da diarreia viral bovina, parvovírus bovino, vírus da língua azul, reovírus, adenovírus bovino, vírus sincicial respiratório bovino e vírus da raiva). Testamos células FBK e Vero cultivadas na presença de 15% de controle de FBS irradiado com gama de acordo com os regulamentos 9CFR; as células permaneceram negativas para o vírus CPE e IFA.
Realizamos sequenciamento metagenômico viral do sobrenadante obtido de células Vero exibindo CPE após realizar amplificação de ácido nucleico de iniciador único e independente de sequência e preparação de biblioteca usando um kit de sequenciamento de ligação de gDNA (SQK-LSK109) e Native Barcoding Kit 96 (Oxford Nanopore Technologies, https://www.www.nanoporetech.com). Realizamos o sequenciamento de células de fluxo MinION usando a plataforma GridION (ambas Oxford Nanopore Technologies). Classificamos um total de 13.599 leituras como subtipo H5N1 do vírus da influenza A aviária. A análise de bioinformática identificou o vírus como H5N1 clade 2.3.4.4b genótipo B3.13 (números de acesso GISAID EPI4889248–55). A análise filogenética de sequências de segmentos gênicos concatenados indicou que a sequência do isolado FBS H5N1 agrupou-se no genótipo B3.13 e estava intimamente relacionada às amostras de vacas leiteiras da Califórnia coletadas em dezembro de 2024 (Figura 1). Confirmamos a presença do vírus da gripe aviária A neste isolado usando PCR de transcrição reversa em tempo real (rRT-PCR). Devido à detecção do vírus H5N1 nesta amostra, descontinuamos os testes aleatórios de vírus na amostra original.
Realizamos testes adicionais, incluindo rRT-PCR e isolamento de vírus em cultura de células e ovos de galinha embrionados (ECE), no mesmo lote de FBS, usando 8 amostras recém-alimentadas de 100 ml de amostras não inativadas pelo calor e 5 amostras de 100 ml de amostras inativadas pelo calor (56 ° C por 30 min) para investigar e confirmar a presença do vírus HPAI subtipo H5N1 (Tabela). Testamos todas as 13 amostras de FBS usando o protocolo rRT-PCR baseado em array da National Animal Health Network para o vírus da influenza A aviária, que resultou na detecção de RNA viral de 1 amostra não inativada por calor (046093-25-4) (limiar de ciclo (Ct) 37,7) e 1 amostra inativada por calor (046093-25-9) (Ct 39,1). Para isolar o vírus em cultura de células, seguimos novamente os testes prescritos pelo 9CFR e células epiteliais uterinas Vero e bovinas (CAL-1, conhecidas por serem suscetíveis ao vírus H5N1) semeadas em frascos T75. Cultivamos as células na presença de 15% de FBS e as mantivemos por 7 dias antes da próxima subcultura, totalizando 3 subculturas (total de 21 dias). Monitoramos as células diariamente para CPE. Uma das amostras de FBS não inativadas pelo calor (046093-25-2) apresentou CPE em células Vero (Figura 2), e confirmamos o isolamento do vírus influenza A usando rRT-PCR específico da matriz (Tabela).
Para aumentar a sensibilidade do isolamento do vírus, também testamos amostras de FBS usando o isolamento do vírus ECE. Submetemos 15 mL das amostras originais à ultracentrifugação (32.000 rpm por 1 h 30 min) em uma almofada de sacarose (tampão 10 × NTC: NaCl 1 M, Tris-HCL 0, 2 M pH 7, 4, CaCl 50 mM; sacarose 30% (p / v)), em seguida, ressuspensamos o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato 1 ×. Inoculamos ECEs com 10 dias de idade com 0,3 mL de amostras originais não diluídas e diluídas (10:1 e 10:2, solução salina tamponada com fosfato) e 0,1 mL de amostras de FBS ultracentrifugadas por ovo (3 ovos por condição). Monitoramos a viabilidade embrionária diariamente durante 5 dias. Após 5 dias, coletamos o fluido alantóico e o testamos para o vírus da influenza A aviária usando rRT-PCR e ensaio de hemaglutinação, e então os inoculamos novamente no ECE para uma segunda passagem. Isolamos o vírus de 2 amostras de FBS ultracentrifugadas e não inativadas pelo calor. A amostra 046093-25-6 foi positiva em 10−1 diluição, então ultracentrifugamos. Confirmamos o isolamento da influenza por rRT-PCR baseado em array e ensaio de hemaglutinação. Uma amostra (046093-25-7) foi negativa pelo ensaio de hemaglutinação às 10−1 diluição após a primeira passagem na CEE, mas o teste do líquido alantóico foi positivo pela matriz rRT-PCR (Ct 31).
As tentativas de confirmar o isolamento do vírus nos Laboratórios Nacionais do Serviço de Inspeção de Animais e Plantas do USDA (Ames, IA, EUA) não tiveram sucesso. A baixa taxa de detecção do vírus GAAP H5N1 no lote de FBS testado (mesmo quando testado usando rRT-PCR) e a falta de detecção de vírus sugerem uma carga viral baixa (provavelmente <1 partícula infecciosa/mL) neste lote de FBS agrupado.
Dadas as nossas descobertas e a suspeita de viremia em vacas leiteiras infectadas em lactação (2,7,8), realizamos testes adicionais em amostras individuais de FBS coletadas em matadouros na Califórnia (n = 384) e no Texas (n = 384). Entre essas amostras, 1 testou positivo por array rRT-PCR para o vírus da gripe aviária A (Ct 35). Este achado no soro fetal apoia a hipótese de que a viremia esporádica de GAAP em bovinos leiteiros permite que o vírus atinja diferentes tecidos.7,8), incluindo, em casos raros, o feto. Relatórios de fazendas leiteiras sugerem que novilhas infectadas com H5N1 sofreram complicações reprodutivas, incluindo aborto, após infecção pelo vírus HPAI H5N1 (9).
Em seguida, avaliamos a eficiência de inativação térmica do FBS para o vírus HPAI. Tratamento térmico de soro (alíquotas de 1 mL enriquecidas com ≈7 log10 50% de dose infecciosa de cultura de tecidos/mL) a 56°C por 30 min inativou o vírus (Figura 3).
