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Autoria: Instituto Robert Koch, Berlim, Alemanha (C. Kohl, T. Muzeniek, T. Perera, D. Bas, M. Öruc, A. Brinkmann, B. Becker-Ziaja. F. Schwarz, A. Nitsche); Universidade de Colombo, Colombo, Sri Lanka (S. Siriwardana, T. Perera, J. Weerasena, S. Khanduneti, IK Perera, S. Premawansa, V. Yapa); Ministério da Saúde, Colombo (H. Jeevatharan); Hospital Universitário Colombo Norte, Ragama, Sri Lanka (G. Premawansa)
Vírus Nipah (NiV; Henipavírus nipehense) e vírus Hendra (H. hendraense) são espécies dentro do gênero Henipavírus da família Paramyxoviridae (1). Vários paramixovírus, incluindo o vírus do sarampo e o vírus sincicial respiratório, causam doenças respiratórias graves e são frequentemente transmitidos pelo ar. O NiV pode causar surtos graves em humanos; seus sintomas clínicos variam de infecção subclínica a encefalite grave, doença respiratória e morte (2). A taxa de letalidade (CFR) relatada de encefalite por NiV foi de 61% (IC 95% 45,7% –75,4%) (2,3).
O NiV apareceu em 1998 na Malásia e em Cingapura (4). Surtos subsequentes foram relatados em Bangladesh, Filipinas e Índia; resultaram em >643 infecções confirmadas laboratorialmente e 380 mortes (2). Morcegos (raposas voadoras, Pteropo spp.) são os hospedeiros reservatórios conhecidos do NiV (5). A transmissão de morcegos para humanos ocorre através da exposição à urina, seja através do consumo de seiva de palma crua contaminada com excrementos de morcego, contato direto com hospedeiros intermediários infectados (por exemplo, porcos) ou contato direto com urina de morcego.5). Em 2023, vários casos do vírus Nipah foram relatados em Kozhikode, distrito de Kerala, na Índia, e nos distritos de Dhaka, Rajbari e Shariatpur, em Bangladesh (6). A distância mais curta entre Ilha de Mannar, Sri Lanka e Natarajapuram, Índia é <55 km; Pteropo spp. relata-se que morcegos migram >450 km com facilidade (7). Neste estudo observamos a urina secretada por diversas colônias de P. médio morcegos no Sri Lanka quanto à presença de vírus usando técnicas moleculares. Nosso foco foi investigar se o NiV está presente no Sri Lanka e determinar as medidas necessárias para prevenir a propagação aos seres humanos. Obtivemos aprovação ética para este estudo do Instituto de Biologia do Sri Lanka (WL/3/2/05/18) e a permissão necessária do Departamento de Conservação da Vida Selvagem do Sri Lanka.
Em março de 2018 – junho de 2019 observamos P. médio patógeno eliminando colônias de morcegos em Colombo, Mannar, Anuradhapura e Badulla, Sri Lanka. No início da manhã, colocamos folhas de amostragem limpas sob as árvores empoleiradas e pela manhã transferimos a urina excretada gota a gota para placas de microtitulação estéreis usando pipetas descartáveis. Realizamos todo o trabalho usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado, conforme descrito acima (5).
Coletamos um total de 2.218 amostras de urina e as combinamos em 32 pools com <8 amostras de urina cada. Extraímos o RNA dos pools individuais usando o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, https://www.qiagen.com). Nós rastreamos o vírus Nipah usando PCR em tempo real visando o gene da fosfoproteína (P), conforme descrito anteriormente (8). Como confirmação adicional, desenvolvemos uma PCR em tempo real visando a proteína do nucleocapsídeo do genoma do vírus Nipah (Tabela 1).
Usamos Illumina HiSeq (https://www.illumina.com) para alinhar os grupos positivos de NiV S3_P02 e S18_P08 (2 de 32 grupos). Cortamos usando Trimmomatic (9) e mapeado para a cepa NiV MCL-18-H-1088 (número de acesso MHK523642; Kerala, Índia) como cepa de referência. Além disso, desenvolvemos um painel de primers AmpliSeq, NiVliSeq abrangendo todo o genoma do NiV usando o Primer3 versão 2.3.7 (Figura 1; Tabela no Suplemento). Sequenciamos os produtos de PCR correspondentes na plataforma MinIon conforme descrito anteriormente (10,11). Enviamos rascunhos de genomas ao GenBank (números de acesso PP893186–9) e os alinhamos com cepas de NiV e genomas de espécies-tipo de paramixovírus designados pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus e disponíveis no GenBank. Calculamos uma reconstrução filogenética do relógio molecular com o software MrBayes versão 0.39 (https://nbisweden.github.io/MrBayes), usando uma abordagem de Monte Carlo de cadeia de Markov para reconstruir o relógio molecular com base no modelo geral reversível no tempo com parâmetros definidos em 1 milhão de réplicas, 4 cadeias e um burn-in de 10% (grande sequência parcial 7.977 nt; codificando o gene da RNA polimerase dependente de RNA, subfamília Orthoparamyxovirinae).
Coletamos o pool S3_P02 e o pool S18_P08 em Colombo; ambos os testes foram positivos para NiV usando PCR quantitativo de henipavírus (qPCR) visando o gene P (8). NiV qPCR (direcionado ao gene do nucleocapsídeo) confirmou ainda mais o NiV nos mesmos conjuntos de amostras (Tabela 2). O sequenciamento revelou leituras de NiV correspondentes nos dois conjuntos de amostras que mapeamos para todo o genoma do NiV (Tabela 2), fornecendo confirmação adicional. A abordagem NiVliSeq revelou 93% do genoma NiV do conjunto S3_P02 e 98% do genoma NiV para o conjunto S18-08 (Tabela 2). A comparação dos genomas do NiV com o banco de dados GenBank revelou a maior identidade para uma cepa coletada de um paciente humano durante o surto de 2018 em Kerala, Índia (número de acesso MH396625); os genomas do conjunto S3_P02 e do conjunto S18-08 têm 98% de identidade de nucleotídeos com a cepa Kerala. Nomeamos as cepas de NiV do Sri Lanka de acordo com o sistema usado para as cepas na Índia: cepa NiV C-18-B-0302 Sri Lanka (número de acesso PP893186.1) e cepa NiV C-19-B-1808 Sri Lanka (número de acesso PP893188.1). Nesta nomenclatura, C significa Colombo, 18 e 19 indicam os anos de 2018 e 2019, B significa morcego e os restantes números representam o número da amostra.
A análise filogenética atribuiu as novas cepas do vírus Nipah C-18-B-0302 Sri Lanka e C-19-B-1808 Sri Lanka à espécie Nipah virus (H. nipahense) dentro do gênero Henipavírus (Figura 2). Ambos agruparam-se monofileticamente com as cepas amostradas de humanos durante os surtos de 2007, 2018, 2019, 2021 e 2023 na região de Kerala, na Índia.
Este estudo demonstra a presença de cepas de NiV no Sri Lanka. A abordagem de sequenciamento qPCR e NiVliSeq que desenvolvemos valida resultados obtidos anteriormente e representa ferramentas valiosas que podem ser usadas em estudos posteriores. As cepas identificadas têm a maior semelhança com cepas patogênicas humanas que causaram surtos recentes na Índia (2007, 2018, 2019 e 2023). No entanto, o NiV ainda é uma doença rara e as taxas de transmissão são relativamente baixas. Além disso, a detecção de um determinado vírus numa população de morcegos não significa necessariamente que esteja a ocorrer transmissão; diferentes cepas de henipavírus podem ser encontradas em Pteropo spp. morcegos em toda a sua extensão.
A prevenção inicial de qualquer infecção deve ser um dos objetivos principais e pode incluir a proteção dos morcegos e dos seus poleiros. As colónias de morcegos são vitais para ecossistemas saudáveis e devem ser protegidas por diversas razões, incluindo os serviços ecossistémicos que prestam, como a polinização e a dispersão de sementes. além disso Pteropo spp. morcegos estão em perigo (12). A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconhece a necessidade de pesquisa e diagnóstico do NiV na faixa de distribuição de Pteropo spp. (13).
Compreender os mecanismos que influenciam a eliminação do NiV provavelmente impedirá uma maior propagação; A eliminação de NiV provavelmente também segue pulsos sazonais e temporais relatados anteriormente para o vírus Hendra (14–15). Reconhecemos que o aparecimento de doenças pode resultar de perturbações nos sistemas ecológicos e, portanto, não pode ser atenuado por novas perturbações. Por ser um país tropical, o Sri Lanka possui ecossistemas complexos e diversos; a sua resiliência às alterações climáticas pode ser melhor do que a de outras regiões do mundo.
O potencial de transmissão zoonótica do NiV de morcegos para humanos pode ser minimizado por medidas preventivas. Tais medidas poderiam incluir a educação dos profissionais de saúde para aumentar a conscientização adequada sobre o NiV, equipamentos e treinamento para detecção precoce de RNA do NiV em amostras clínicas, preparação para o manejo clínico de pacientes positivos para o NiV e mensagens ao público para evitar rotas conhecidas de infecção para prevenir a transmissão (ou seja, cercas de árvores com morcegos empoleirados).
Dr. Kohl é cientista do Instituto Robert Koch em Berlim, Alemanha, no Centro de Ameaças Biológicas e Patógenos Especiais. Os seus interesses de investigação são a detecção de vírus emergentes e reemergentes e a caracterização de novos agentes patogénicos, particularmente de morcegos.
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